1背景

来自于匈牙利的团队使用了一种创新的基于拉曼光谱的监控系统，用于设计动态补料策略，使中国仓鼠卵巢细胞(CHO)培养中关键细胞营养物质维持在理想水平。针对葡萄糖、乳酸和16个单个氨基酸建立的偏二乘校准模型具有很好的预测能力，均方根误差值低，平方相关系数高。所开发的用于实时测量营养物质和副产品浓度的模型，使研究人员能够更好地了解细胞的代谢行为和营养物质的消耗。

 

为了细胞建立更有益的营养环境，结合拉曼模型（葡萄糖和精氨酸）的预测，采用了两种动态补料策略来控制两部分多组分（two-part multi-component ）培养基的添加。因此，营养物质能（葡萄糖和氨基酸）保持在相对稳定的水平，而不是高波动，这为细胞提供了一个更平衡的环境。此外，与葡萄糖动态补料培养相比，基于氨基酸的补料控制可以防止营养物质过量，并显著减少培养基的供给，具有经济效益。

 

2材料

2.1细胞系

使用表达阿达木单抗（Abbvie）的CHO-DG44细胞系进行细胞培养实验。


2.2反应器与条件

生物反应器培养实验在2L工作体积的Applikon玻璃生物反应器中进行，目标初始密度为5×105个细胞mL-1。使用Ez控制系统（Applikon Biotechnology）在所需设定点控制以下工艺参数：搅拌速度（120 rpm）、温度（37℃）、DO（40%）和pH（7.1）。利用BioXpert软件，通过局域网连接，每10 min采集培养参数。


2.3拉曼光谱收集

在细胞培养过程中，使用Kaiser raman RXN2 Hybrid system收集拉曼光谱，使用不锈钢浸没式MR探头通过光纤收集拉曼信号，拉曼探头在高压灭菌培养前与生物反应器一起进行灭菌。光谱采集范围为200-1890cm?1，分辨率为1cm?1。采集的系统设置为75次曝光次数，曝光时间为10秒。生物反应器覆盖铝箔以保护其免受光。


2.4模型处理

利用化学计量学工具分析拉曼监测过程中生成的大型多维数据集，并提取相关的过程信息。采用PLS回归方法，通过将拉曼光谱（作为独立的X变量）与其对应的离线测量参考浓度（作为因Y变量）联系起来，建立了葡萄糖、乳酸和氨基酸组分的校准模型。


2.5补料

在生物反应器中添加补料溶液以补充细胞的营养物质：两部分多组分补料培养基（ActiCHO Feed A and Feed B，GE Healthcare）和400 g L-1葡萄糖（Sigma-Aldrich）原液。


2.6两种补料策略

采用两种基于葡萄糖和精氨酸的动态补料策略，使细胞的营养物质保持在所需的浓度。在以葡萄糖为基础的动态补料实验中，基于拉曼监测的葡萄糖浓度（GLC）来控制营养补充。如果GLC低于11 mM的设定值，则使用两部分多组分补料培养基（Feed A和Feed B）进行补料，以将葡萄糖限制在11 mM的低水平。除此之外，不需要额外的葡萄糖。因此，双组分饲料培养基中所含的所有营养成分都按指示剂葡萄糖的比例添加。

在基于氨基酸的动态补料实验中，补料策略是基于拉曼监测的GLC和精氨酸浓度（ARG）调整三种料液的补加（Feed A和Feed B和单独的葡萄糖原液）。目的是将ARG水平维持在2.5 mM的设定值，同时将葡萄糖限制在11 mM的低水平。


2.7PLS模型

图1：PLS模型用于校准（灰色圆圈）和验证点（红色菱形）输出的预测与测量的葡萄糖(A)和乳酸(B)浓度值的图

 

为了研究拉曼模型的预测性能，研究人员采用了一个独立的生物反应器培养实验作为验证运行。图1A和B显示了离线测量的葡萄糖和乳酸浓度与拉曼预测浓度，其中灰色圆圈为校准，红色菱形为验证样品。两种拉曼模型都能准确估计葡萄糖和乳酸的低RMSEP值分别为1.64和4.51 mM，高r2值分别为0.986和0.998，效果较为理想。

图2：在PLS回归过程中，拉曼预测和离线测量数据之间的相关性：丙氨酸(A)、精氨酸(B)、苯丙氨酸(C)和缬氨酸(D)。校准数据集用灰色圆圈表示，测试数据集用红色菱形表示

 

表2：20种氨基酸成分构建的偏二乘模型的性能(用于校准、交叉验证和预测)

研究人员建立了ALA、ARG、ASP、ILE、LEU、PHE、GLU、THR、VAL和LYS的模型，其中平均RMSEC和RMSECV误差值分别为用于校准的浓度范围平均值的8 ± 1%和10 ± 1%。这些PLS模型的一些预测能力的例子如图2A-D所示。可以看到，数据点（灰色圆圈）围绕着理想的1：1线，这意味着模型提供的拉曼预测接近参考浓度测量值。

 

3结果

葡萄糖的动态补料：基于拉曼监测GLC水平自动控制多组分补料培养基（补料A和补料B）

 

拉曼的过程控制在培养第4天（第93小时）前不久开始。此后，通过连续添加补料A（补料B培养基为补料A体积的1/10），将GLC保持在所需的低水平（11 mM），持续4天。在整个生物反应器运行过程中，为细胞总共补加了大约240 mL的补料A和24 mL的补料B。然而，由于使用多组分补料培养基将GLC调整到所需的水平，所有其他组分都根据两种培养基的化学计量组成按葡萄糖比例供应。这种方法的主要缺点是可能会过度补料其他营养物质。

基于氨基酸的动态补料培养实验：ARG(A)和GLC (B)的拉曼在线监测和营养物质补料的自动控制。多组分补料培养基（补料A和补料B）的添加，同时提供浓缩葡萄糖原液以避免葡萄糖耗尽。

 

其目标是将葡萄糖和额外的关键营养物质保持在一个可接受的浓度范围内，从而确保细胞处于一个平衡的培养环境。ARG和GLC的设定点分别为2.5mM和11 mM。此外，研究人员还设定了一个葡萄糖的上限（15 mM），以避免过量，因为补料A培养基中含有500 mM的葡萄糖。

 

在实验后期，观察到ARG模型预测的误差略有增加（图4A）。因此，ARG保持在低于期望的2.5 mM的较低水平，这表明未来需要进一步的模型优化。相比之下，GLC在目标点11 mM左右（在9到13mM之间）发生变化（图4B）。比较提供的多组分饲料培养基的累积体积，在氨基酸动态补料实验中，分别补加了100 mL Feed A和10 mL Feed B，不到葡萄糖动态补料实验的一半。此外，当所提供的补料A培养基不能将GLC水平提高到11 mM时，向反应器中添加单独的葡萄糖原液（2220 mM）。在整个培养实验中，添加37 mL葡萄糖原液和100 mL补料A培养基后，总共需要132 mmol葡萄糖来维持所需的GLC水平。因此，侧面证明了当使用基于葡萄糖的补料策略调整添加培养基时，部分营养物质存在过量添加的情况。

 

4结论

两种动态补料培养的细胞密度(A)、活力(B)和产物滴度(C)

 

基于拉曼技术开发的两种控制策略，很好地完成了对目标参数的监控和闭环补料控制。其中，采用基于葡萄糖的动态饲养策略，可以将葡萄糖浓度限制在一个恒定的低水平，但补料培养基中的其他营养物质含量在培养结束时会过量并积累。相比之下，新开发的精氨酸补料策略可以有效地将氨基酸和葡萄糖的浓度控制在一个狭窄的范围内，从而为细胞建立一个更稳定的生长环境。比较两种补料策略对培养性能的影响，两种策略在细胞密度、活力和产生的抗体浓度方面的结果相似。但是，与基于葡萄糖的动态补料策略相比，基于精氨酸的动态补料策略可以显著减少（一半以上）添加的累积量，减少了培养过程中培养基的使用量，提高了生产效率。


Domján, J., Pantea, E., Gyürkés, M., Madarász, L., Kozák, D., Farkas, A., Horváth, B., Benk?, Z., Nagy, Z.K., Marosi, G. & Hirsch, E. 2022, "Real‐time amino acid and glucose monitoring system for the automatic control of nutrient feeding in CHO cell culture using Raman spectroscopy", Biotechnology journal, vol. 17, no. 5, pp. e2100395-n/a.